Prezenta anomaliilor cromosomiale in LMNH a fost raportata din urma cu mai mult de 30 de ani. Aceste modificari, cu caracter clonal, au fost practic constante in toate cazurile de LMNH. Tehnicile de bandare cromosomiala, utilizate initial, au demonstrat existenta unor modificari numerice cromosomiale, dar mai ales a unor anomalii cromosomiale structurale (3). Dupa anul 1985, in biologia moleculara a limfoproliferarilor au fost facute progrese importante prin introducerea de noi tehnici de studiu. Astfel, tehnica de transfer a ADN-ului de pe un suport pe altul (Southern blotting), donarea ADN, amplificarea (multiplicarea) secventelor de ADN cu ajutorul reactiei in lant a polimerazei (PCR) sau hibridizarea in situ, au devenit metode deosebit de importante pentru studiul alterarilor genetice si monitorizarea LMNH (2,12).
Recent studiul secventelor ADN din portiunile terminale ale cromosomilor (asa numitii telomeri) si a produsilor proteici implicati in mentinerea acestor structuri genice (telomeraze) a adus noi elemete in sprijinul clarificarii unor aspecte de biologie moleculara si de citogenetica a LMNH, deschizand noi perspective pentru aprecierea rolului insilitatii genomice in patogeneza si clinica limfoproliferarilor maligne.
Biologia moleculara a permis intelegerea amanuntita a dezvoltarii limfocitelor B si T, incluzand informatii asupra rearanjarii genelor pentru Ig si a genelor care codifica TCR. Monoclonalitatea a fost demonstrata pentru cea mai mare parte a LMNH (4). Majoritatea LMNH (atat cele de tip B, cat si cele de tip T) prezinta translocatii cromosomiale reciproce caracteristice, cu "rupturi" ("breakpoints") interesand locusuri ale Ig sau TCR. Aceste translocatii, cu rearanjari ale genelor, duc la modificarea expresiei unor gene (gena partenera) si actirea oncogenelor afectate, reprezentand momente importante in limfomoqeneza (12,16).
Caracterul extrem de heterogen al clasificarii histologice a LMNH este regasit si in studiile citogenetice. Un cariotip anormal este obsert in peste in peste 90% dintre LMNH, relatia dintre anomaliile cromosomiale specifice si formele histologice ale limfoamelor fiind mai putin sistematizata decat in cazul leucemiilor acute (2). Se poate totusi afirma, in prezent, existenta unei corelatii stranse intre tipul oncogenei afectate, anomaliile clonale neintamplatoare (sistematizate), si aspectele morfo-clinice si fenotipice ale LMNH (14,21).

Oncogene implicate in LMNH

Asa dupa cum s-a amintit la modulul de patogeneza a LMNH, leziunile genetice din aceste limfoproliferari intereseaza (9,21):
1. proto-oncogenele, reglatoare ale cresterii celulare si codificatoare ale unor proteine transmitatoare de semnale mitogenice: factori de crestere, receptori membranari, mesageri secundari citoplasmatici si factori de transcriptie intra-nucleara.
Proto-oncogenele cele mai interesate in cursul LMNH sunt BCL-l/Cyclin D1, BCL-2, BCL-6, c-MYC, NPM/ALK). in urma unor alterari structurale (mutatii punctiforme, translocatii, amplificari genice sau hiperexprimari) ele se transforma in forme active (oncogene), cu afectarea cresterii celulare si dereglare transcriptionala. Aceasta actiune, cu rol in limfomogeneza, se exercita autosomal dominant (este suficienta alterarea unei singure alele pentru obtinerea efectului cancerigen).
2. genele supresoare (anti-oncogenele), inhibitoare ale cresterii si proliferarii celulare, cele mai cunoscute fiind gena p si gena retinoblastomului. Modificarea genelor supresoare contribuie la procesul de cancerizare intr-un mod autosomal recesiv (necesita alterarea ambelor alele).In elul nr. 3.4.1. este prezentata distributia interesarii genelor in diferite tipuri histologice de LMNH (9).

Asa dupa cum reiese din el, in cazul limfoamelor indolente (limfomul limfocitic cu celule mici) apar mutatii ale genei supresoare p in 10% din cazuri, procent care creste pana la 70% in situatia transformarii acestui limfom intr-un sindrom Richter; acest fapt sugereaza ca leziunea genetica in cauza este in stransa legatura (din punct de vedere potogenetic) cu progresia limfomului cu limfocite mici B. Limfomul limfoplasmocitoid este caracterizat prin actirea genei PAX-5 (un factor de transcriptie al limfocitului B) in aproximativ 50% din cazuri, in timp ce in limfomul folicular leziunea genei BCL-2 (implicata in reglarea negati a apoptosisului si in asigurarea supravietuirii celulare) caracterizeaza 90% din cazuri. Progresia unui limfom folicular intr-o forma mai agresi (limfom difuz cu celule mari) este acompaniata de asocierea la leziunile oncogenei BCL-2, a unor mutatii in gena supresoare p Limfomul cu celule din zona mantalei este caracterizat (in 70% din cazuri) prin actirea oncogenei BCL-l/Cyclin D, si (mai rar) prin mutatii ale genei p (9,21).
Dintre limfoamele B cu malignitate crescuta, limfomul difuz cu celule mari este caracterizat printr-o anumita heterogenitate genetica: 40% din cazuri evolueaza cu leziuni ale genei BCL-6, 20% din cazuri cu leziuni ale genei BCL-2 si 20% din cazuri cu modificari ale ambelor oncogene. Limfomul Burkitt este asociat in toate cazurile cu actiri ale oncogenei c-MYC si frecvent cu mutatii ale genei supresoare p Infectia cu VEB este prezenta in 100% din formele endemice si in 30% din formele sporadice de limfom Burkitt. O entitate recent descrisa de LMNH (Cesarman E., citat de 9) prezent in fluidele unor cavitati in absenta de tumori solide (BCBL = "body cavity-based lymphoma"), este asociat in 100% din cazuri cu infectia clonei tumorale cu virusul herpetic 8 (HHV-8) si cu VEB.

Originea si structura translocatiilor cromosomiale
Translocatiile din LM deplaseaza oncogenele la contactul cu genele pentru Ig si pentru TCR, cauzand rearanjari ale acestora cu ajutorul unor enzime (recombinaze) . Rearanjarile moleculare sunt cel mai bine descrise in limfoamele cu celule B, translocatiile caracterizandu-se prin rupturi cromosomiale in dreptul locilor genei pentru lantul greu (H) de Ig (la 14q32) si a oncogenelor BCL-2 (la 18q33) sau c-MYC (la 8q24).
Cromosomul 14, pe care se afla fragmentul de gena pentru receptorul antigenic este considerat in citogenetica LMNH ca un element "comun", el fiind interesat de marea parte a translocatiilor cromosomiale descrise in procesul de limfomogeneza. Ruperea fragmentului amintitei gene de pe cromosomul 14 favoriza translocarea la acest nivel a unei noi gene, proces care permite apoi codificarea unor proteine cu rol in cancerizare (oncoproteine). Anomaliile cromosomiale cel mai frecvent descrise sunt prezentate in elul nr. 3.4.2.
1. Translocatia t(14;18) este descrisa in limfoamele follculare (85% din cazuri) sau in anumite cazuri de limfoame difuze de tip B (20% din cazuri). Pornindu-se de la acesata translocatie s-a realizat clonajul genei BCL-2, care codifica o proteina inhibitoare a apoptosisului (mortii celulare programate) si care in LMNH este de structura normala, dar supraexprimata; productia crescuta a acestei proteine favorizeaza prelungirea vietii celulelor limfomatoase (antaj de crestere, cu acumularea celulelor in stadiile G0 si G0, cu posibilitatea de aparitie a noi perturbari cromosomiale (de ex. alterari ale c-MYC) si de transformare a LM intr-o forma mai agresi (5,10,12).
Proteina BCL-2 este prezenta in mod normal in membranele mitocondriale si nucleare si mai putin intracitoplasmatic. Este bine exprimata in zona celulelor mantalei (favorizand aparitia de limfocite circulante cu durata lunga de viata), ca si in zona medulara a timusului si in anumite epitelii glandulare hormono-sensibile . Desi LM prezentand t(14;18) au un fenotip matur, cele mai multe date indica faptul ca anomalia cromosomiala se produce in stadiul "pre-B" al maturatiei limfocitare . Oncogena BCL-2 este descrisa si in celule benigne sau maligne fara a fi prezenta t(14;18). De mentionat ca t(14;18) poate fi intalnita in LMNH primare ale glandelor salire ca si in 10% din LLC si foarte rar in LA. in ultimii ani s-a ansat si ideea dupa care t(14;18) este insuficienta pentru aparitia neoplaziei, ea reprezentand doar un prim pas in cadrul unei serii de alterari genetice care duc la malignizarea (12,21).
2. Translocatia t(8,14), caracteristica limfomului Burkitt, a fost prima anomalie cromosomiala demonstrata in LM. Aceasta translocatie, ca si riantele sale t(2;8) si t(8;22), este prezenta in cel putin 75% din cazurile de limfom Burkitt (1,4,7). Oncogena interesata este c-MYC, care codifica o proteina din familia
actorilor de transcriptie, atasata de ADN; actirea transcriptionala a mai multor gene este responsabila de o proliferare celulara necontrolata si de diminuarea maturatiei celulelor afectate . Translocatia t(8;14) prezinta o riabilitate moleculara (interactiuni diferite intre c-MYC si genele pentru Ig) care permiteIstinctia intre cele doua riante de limfom Burkitt (endemic si sporadic) (. 3.4.2.).
Proteina codificata de c-MYC formeaza heterodimeri cu o alta proteina nucleara (numita MAX) cu ajutorul careia se fixeaza de ADN. Acesti heterodimeri MYC/MAX pot duce la transformarea si proliferarea limfocitelor B, riscul pentru aparitia unui LM fiind crescut ca urmare a interventiei VEB .In afara limfomului Burkitt, rearanjari ale genei c-MYC mai apar in unele LMNH de malignitate crescuta. Tumorile asociind translocatii ale BCL-2 si c-MYC sunt agresive si se prezinta ca forme cu celule mari fara arhitectura foliculara. in aceste cazuri, foarte verosimil, rearanjarea c-MYC este aditionala si responsabila de transformarea unui limfom folicular intr-unui de malignitate crescuta. in LMNH asociate infectiei cu HIV, translocatiile MYC sunt in mod particular asociate cu forme histologice de tip Burkitt, caracterizate in acelasi timp de anomalii frecvente ale genei p .
Translocatia t(8;14) a fost printre primele anomalii cromosomiale descrise in LM cu celule T; genele implicate sunt oncogena c-MYC si gena pentru TCRa. Analizarea exprimarii genei c-MYC in LM cu celule T in care t(8;14) este prezenta, indica faptul, ca analog cu LM de tip B, si in primele activitatea transcriptionala a acestei gene este perturbata (14,18).
3. Translocatia t(11;14) apare in urma rearanjarii genei BCL-l si are ca efect sinteza unor proteine (ciclina D) cu efect asupra ciclului celular (stimuleaza trecerea din faza G1 in faza S). Este o anomalie cromosomiala intalnita in LM centrocitice sau provenite din celulele zonei mantalei ganglionare (MCL) si este responsabila de cresterea proliferarii celulare. in prezent, detectarea oncogenei BCL-l /Cyclin D actite este considerata a fi criteriul cel mai specific pentru diagnosticul clinico-patologic al MCL. Recunoasterea MCL in cadrul grupului LM iefolicular cu celule mici este deosebit de importanta, intrucat MCL este ieresponsiv la terapia conventionala si necesita recurgerea la scheme mult mai agresive (9). Translocatia t(11;14) (q13;q32) a mai fost descrisa si in alte hemopatii maligne: limfoame cu celule mixte, leucemia polimfocitara B, mielomul multiplu (6,12).In unele LM cu celule T aparitia t(11;14) este urmarea rearanjarii genei TCL-2 si a genelor pentru TCRa .
4. Anomaliile genelor supresoare. Situata pe cromosomul 17, gena p codifica un factor de transcriptie care este proteina p Aceasta activeaza o gena codificatoare a unei alte proteine (de 21 kD), capabila sa inactiveze enzimele de tip kinaze ciclin-dependente care controleaza intrarea celulelor in ciclul celular. in conditii normale gena p limiteaza proliferarea celulara si poate induce apoptosisul celulelor care prezinta leziuni ireversibile ale ADN .In LMNH apar frecvent mutatii ale genei p53, evidentiindu-se prezenta unei deletii, efectul oncogen fiind recesiv. Cel mai adesea, anomaliile genei supresoare p sunt descrise in LM produse de HTLV-l, in limfomul Burkitt, in limfoamele cu limfocite mici diferentiate si in anumite LM asociate infectiei cu HIV. Absenta proteinei p inlatura oprirea ciclului celular in faza G1 in timpul rearanjarii IgH In limfocitele B imature si accelera proliferarea celulara precum si fenomenul de apoptosis .
Gena supresoare RB (retinoblastom), situata pe 13q14, codifica o proteina ce actioneaza ca un reglator negativ al intrarii celulelor in ciclu. Anomalii ale expresiei genei RB, precum deletia 6 (q25-27), au fost raportate intr-un numar de LMNH de inalta malignitate, mai ales in cele asociate infectiei cu HIV (10,21).
Asa dupa cum s-a mai amintit, pentru progresia unor LM dintr-o forma de malignitate joasa inspre una cu un grad crescut de malignitate este necesara aparitia unor modificari citogenetice aditionale. Frecvent, aceste modificari se produc la nivelul genelor supresoare. Exemplul cel mai concludent il reprezinta limfomul Burkitt. In acesta, modificarea genei c-MYC si existenta translocatiei t(8;14) in combinatie cu exprimarea genelor latente VEB nu sunt suficiente pentru dezvoltarea neoplaziei. Este necesara, in acest scop, si aparitia unor mutatii ale genei supresoare p .
5. Analiza genetica a translocatiilor cromosomiale tipice limfoamelor B si T a contribuit la identificarea de noi proto-oncogene; intrucat produsul lor este, in general, o proteina cu rol de factor transcriptional, capacitatea fuzionara a acesteia poate contribui la perturbarea fenomenului de transcriptie (10,21).
a gena ALK, raspunzatoare de translocatia t(2;5), este gena unei tirozin-kinaze si prezinta omologie cu receptorul insulinei. Rezultatul translocatiei, caracteristica LMNH anaplazice cu celule mari, il reprezinta fuziunea genei ALK (la 2p23) cu gena NPM (la 5q35) si care codifica o proteina nucleolara.
a gena BCL-6 situata pe locusul 3q27, recent donata, codifica o proteina cu functie transcriptionala. Aceasta proteina, intalnita in conditii normale in muschiul striat, este supraexprimata in unele forme de LMNH. Astfel, gena BCL-6 este actita ca urmare a unei translocatii de tipul t(3;14); alterarile moleculare ale acestei gene sunt intalnite in 20-40% din LM difuze cu celule mari (9,21).
a gena BCL-3, situata pe locusul 17c22, codificatoare a unui factor transcriptional, este rearanjata in 1-2% din LMNH de tip B, mai ales in caz de progresie histologica a unor LM foliculare purtatoare deja a translocatiei t(14;18).In afara acestora, in prezent se afla in curs de caracterizare si alte oncogene. Astfel, gena FAS situata pe locul 10q23, regiune cromosomica frecvent alterata in LMNH, este implicata in apoptosisul anumitor linii celulare limfoide, ca urmare a legarii unui anticorp specific cu proteina FAS membranara.
Deletiile bratului lung al cromosomului 6, obserte frecvent in LMNH, sugereaza eventuala prezenta a unei gene supresoare tumorale in aceasta regiune. Anumite tirozin-kinaze limfocitare specifice (LCK), gena P18 si secvente localizate pe locusul 11q ar putea fi implicate in cresterea tumorala a unor LMNH. in LM limfoblastice B sau T au fost recent descrise si modificari ale altor oncogene (MLL, ELA, TAL1, TCL-5, TFG-l, TFG-2, PBX) frecvent afectate in leucemiile acute; translocatiile pot fi numeroase, cele mai bine cunoscute fiind t(4;11) si t(1;19), cu producerea unor proteine cu activitate de factori transcriptionali (10,21).

Implicatii clinice ale modificarilor citogenetice

1. Studiul oncogenelor si al modificarilor citogenetice din LMNH are importanta diagnostica (5,9,10,12,13,20,21). Detectia proteinei BCL-2 ajuta diferentierea intre un limfom folicular si o hiperplazie foliculara reactionata, expresia acesteia fiind dovedita in peste 85% din LMNH foliculare. Evidentierea rearanjamentelor genei BCL-2 prin tehnica PCR (pe tesut congelat, din sangele periferic sau pe aspiratul medular, pe tesuturi incluse in parafina), cu analiza precisa a punctelor de rupturi genice a BCL-2 si detectarea cu mare sensibilitate a celulelor tumorale, este utila in diferentierea LM foliculare de alte LMNH de malignitate scazuta.Intrucat datele actuale arata existenta unui profil al anomaliilor moleculare destul de caracteristic pentru fiecare forma histopatologica, cunoasterea oncogenelor alterate si/sau a factorilor de crestere reprezinta un important element pentru o mai corecta clasificare a LMNH. Acest aspect a fost luat in considerare si in noua clasificare (REAL) a LMNH. Se poate aprecia ca, in viitor o clasificare "moleculara" fi una mai rationala si putea completa actualele sisteme morfologice aflate la baza sistematizarii LMNH.
Studiul rearanjarilor genice BCL-2/H cu ajutorul tehnicii PCR permite, de asemenea, depistarea localizarilor intramedulare in cadrul procedurilor de stadializare/restadializare a LMNH ca si evidentierea precoce a determinarilor limfomatoase in sistemul nervos central si in seroase (5,10).
2. Valoarea prognostica a rearanjarilor si expresiei anumitor oncogene a fost apreciata in ultimii ani (5,15). Daca anomaliile genei BCL-2 nu se coreleaza cu o evolutie aparte in cazul LM foliculare, modificarile acestei oncogene in formele difuze cu celule mari se asociaza cu un prognostic rezert, indeosebi in LMNH extraganglionare.
Detectarea proteinei p este considerata un factor de risc pentru transformarea (progresia) histologica a LM foliculare. Asocierea modificarilor oncogenei BCL-2 si a genei supresoare p se coreleaza cu un prognostic nefavorabil.
Actualul index prognostic international tine seama si de conuratia anomaliilor genetice prezente in diferite forme de LMNH .
3. Importanta terapeutica a modificarilor genetice din LMNH este deosebita. Ea se refera atat la silirea unor criterii precise de eluare a bolii minime reziduale, cat si la deschiderea unor noi posibilitati, moderne, de tratament al LMNH.
a. in prezent se tinde inspre aprecierea remisiei postterapeutice a LMNH la nivel molecular (remisie moleculara). Cu ajutorul tehnicii PCR, capabile de a depista o celula maligna la 100.000 de celule, pot fi evidentiate leziuni genetice care intereseaza oncogenele BCL-l, BCL-2, NPM/ALK, iar recent sunt relatate date si privind oncogenele MYC si BCL-6 (9). Aprecierea bolii minime reziduale prin detectarea anomaliilor BCL-2 s-a putut face, cel mai corect, in cazul LM foliculare.
Prezenta de celule limfomatoase reziduale in madu osoasa utilizata pentru transtul autolog este de importanta majora, aceasta necesitand recurgerea la anticorpi monoclonali pentru sterilizarea completa inaintea transtului. Acelasi lucru este labil si pentru precursorii de celule din sangele periferic utilizati pentru autotranst. Detectarea bolii reziduale are importanta si prin prisma apecierii recaderii de boala dupa obtinerea "remisiunii", acest parametru fiind determinant pentru evolutia si supravietuirea bolnavilor cu LMNH. Verosimil ca recaderile de boala sunt datorate prezentei celulelor limfomatoase BCL-2 pozitive care contamineaza madu osoasa sau celulele stern periferice transfuzate (9,12,21).
b. Cunoasterea anomaliilor genetice, intelegerea cooperarii mai multor oncogene intre ele cat si cu factori din mediul inconjurator in producerea LMNH, a deschis perspecti unei terapii moleculare a acestora . Sunt astfel studiate o serie de mijloace de blocare a sintezei sau de neutralizare a proteinelor oncogenice, fie prin ARN sau proteine BCL-2 anti-sens, fie prin analogi proteici capabili de dimerizare, fie prin anticorpi specifici (de ex. anti-FAS, cu inducerea apoptosisului in celulele tumorale). in cazul unei stimulari tumorale prin factori de crestere de tip citokine, se incearca blocarea buclei autocrine sau paracrine prin anticorpi dirijati impotri receptorilor.
Se urmareste, de asemenea, crearea unei imunitati adecte impotri proteinelor oncogenice rezultate in urma translocatiilor sau altor anomalii genetice; incercarile unei imunizari prin "ccinuri" specifice sunt in stadiu.