Īmbunatatiri aduse Īn retinerea enzimelor de filmul de poli(pirol-alginat) Īn elaborarea biosensorilor

 Īmbunatatiri aduse īn retinerea enzimelor de filmul de poli(pirol-alginat) īn elaborarea biosensorilor

1. Introducere

            De-a lungul timpului s-au folosit diferiti polimeri naturali si sintetici pentru incapsularea biomoleculelor, celulelor si microorganismelor pentru scopuri variate. Dintre acestea, alginatul este unul dintre polimerii naturali cel mai promitǎtor folosit la imobilizarea de celule [203, 204] si enzime [205].

            modulul de fatǎ ilustreazǎ superioritatea oferitǎ de un matrix nou sintetizat de pirol-alginat [216] ativ cu cel bazat pe alginatul natural īn elaborarea biosensorilor. De fapt, idea a fost de a demonstrata ca dupǎ electropolimerizarea conjugatului de pirol-alginat (ura 1), īn conditiile īn care alginatul natural este īndepǎrtat, alginatul modificat este retinut de suporturi (electrozi) datoritǎ polimerizǎrii grupelor pirolice grefate. De asemenea, s-a efectuat o evaluare a cantitǎtii de gluco-oxidaza pierdutǎ din matrixul de polipirol-alginat ca a fost atǎ cu cea din matrixul de alginat natural. modulul descrie performantele analitice ale biosensorilor amperometrici bazati pe matrixul de gluco-oxidaza-polipirol-alginat si cel de gluco-oxidaza-alginatul natural [228]

ura 1. Reprezentarea schematicǎ a sintezei compusului pirol-alginat.

2. Prepararea electrozilor cu alginat si polipirol-alginat pentru testele electrochimice

Pentru functionalizarea electrodului de cǎrbune, s-au depozitat pe suprafata sa 3 µl solutie apoasǎ de alginat sau pirol-alginat (2%, w/v) si lǎsat sǎ reactioneze timp de 5 minute cu o picaturǎ de 0.1 M CaCl₂ [217]. Prezenta acestor geluri conduce la o scǎdere marcantǎ a intensitǎtii picului reversibil ativ cu cel obtinut pentru un electrod nemodificat (ura 2). 

            Ambele geluri au fost oxidate prin controlarea potentialului de electrolizǎ īn solutia apoasǎ continānd 0.1 M LiClO₄ timp de 10 minute la 0.93 V fatǎ de electrodul saturat Ag-AgCl-KCl (Ag/AgCl). Polimerizarea presupusǎ a pirol-alginatului a fost eficientǎ, deoarece se observǎ o scǎdere accentuatǎ (-70%) a intensitǎtii picului de oxidare a derivatului de ferocen ativ cu valoarea sa initialǎ (34 µA) obtinutǎ īnaintea procesului de electropolimerizare. Acestǎ crestere īn rezistenta difuzionalǎ reflectǎ formarea lanturilor polimerizate īn structura de gel. Din contrǎ, voltamograma ciclicǎ caracteristicǎ oxidǎrii aliginatului natural prezintǎ o crestere a intensitǎtii curentului de la 32 la 42µA.

ura  2. Voltamogramele ciclice īn prezenta ferocenului dicarboxilic īn tamponul  0.1M Tris-HCl  (pH = 7) pentru (A) (a) un electrod nemodificat de cǎrbune vitros (diametrul de 5 mm), (b) un electrod modificat cu pirol-alginat (3 µl), (c) un electrod modificat cu polipirol-alginat (3 µl) ottinut prin controlarea potetialului de electrolizǎ la 0.93V, (d) identic cu (c) dupǎ imersarea īn solutie de etanol (10 min) si 0.1M tampon fosfat (pH 7) pentru alte 10 minute.(B)(e) un electrod modificat cu  3 µl alginat, (f) un electrod modificat cu 3 µl alginat dupǎ electroliza la potential fix de 0.93 V, (g) un electrod modificat identic cu (e) dupǎ imersarea īn solutie de etanol (10 minute) si īn solutie de 0.1M tampon fosfat (pH 7, 10 minute). Timpul de gelificare a fost de 5 minute īn prezenta agentului de gelificare 0.1 M CaCl_2. Viteza de scanare a fost de 0.1V s^-l.

3.  Studii de permeabilitate

            Pentru a dovedi prezenta lanturilor de polipirol īn gelul de alginat, a fost determinatǎ permeabilitatea filmelor de alginat si polipirol-alginat cu ajutorul experientelor de electrod-disc rotitor  (RDE) la diferite turatii si īn prezenta 1 mM hidrochinona dizolvatǎ īn 0.1 M Tris-HCl (pH = 7) si a ecuatiilor Gough si Leypoldt descrise īn modulul 4 (ura 4).

            Diferenta mare de permeabilitate estimatǎ pentru filmul de alginat si polipirol-alginat (3.65 x 10^-l si respectiv 2.7 x 10^-2 cm s^-l) reflectǎ clar īmpiedicǎrile sterice datorate lanturilor de polipirol generate in situ.

ura 3.  Voltamogramele RDE ale electrodului de platinǎ īn formǎ de disc (diametru = 5 mm) modificat cu polipirol-alginat īn prezenta solutie de hidrochina (1 mM) in tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH=7): (a) 2000; (b) 1500; (c) 1000; (d) 500; (e) 100 rpm/min. Viteza de scanare: 20 mV ¹.

ura 4.  Graficul Koutecky-Levich pentru un electrod nemodificat (a), modificat cu alginat (b) si modificat cu polipirol-alginat (c). Solutia test a fost 1 mM hidrochinonǎ  īn tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH = 7).

4. Biosensori amperometrici bazati pe filmele de alginat si polipirol-alginat

            Pentru evidetierea aplicabilitatii noului matrix sintetizat (pirol-alginatul) au fost elaborati biosensori amperometrici pentru dozarea glucozei. Prin area performantelor analitice ale biosensorilor īn ceea ce priveste valorile de curent maxim (I_max) si de sensibilitate se obtin valori superioare ale I_max = 1.11 µA, si sensibilitatii = 122 µAM^-l  pentru filmul de polipirol-alginat, fata de un I_max = 0.62 µA, si o sensibilitate = 34 µAM^-l  obtinute pentru filmul de alginat (ura 5).

ura 5. Curbele de calibrare pentru dozarea glucozei īnregistrate de electrozii de platina modificati cu alginat-Gox (3 µl) (▲), polipirol-alginat-Gox (3 µl) (■) si 15 μl (♦), ce au fost potentiostati la 0.6 V īn tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH = 7). 

            Aceste rezultate confirma faptul ca procesul de polimerizare induce o crestere a gradului de retentie a moleculelor de Gox, contribuind la īmbunatatirea performantelor biosensorului.

5. Concluzii

            Rezultatele descrise īn acest modul demonstreaza pentru prima data abilitatea polimerizarii electrochimice a unui film de pirol-alginat polimer pre-depozitat pe suprafata unui electrod sub forma de gel. De asemenea este demonstrat prin studii de permeabilitate si de distrugere organica a celor tipuri de polimeri (alginat si polipirol alginat) cum unitatile de pirol contribuie substantial la īmbunatatirea proprietatilor mecanice si chimice ale gelului de alginat. Astfel, matrixul de polipirol-alginat electrogenerat constituie un suport atractiv pentru imobilizarea enzimelor active si īn fabricarea potentiala a biosensorilor pentru diagnosticul medical.