Imunosensorul amperometric pentru detectarea anti-nile west virus igg folosind incapsularea phagilor intr-un film de polipirol(alchil-amonium)

Imunosensorul amperometric pentru detectarea anti-Nile West virus IgG folosind incapsularea phagilor intr-un film de polipirol(alchil-amonium)

1 Introducere

            Īn acest modul este raportatǎ constructia imunosensorilor amperometrici pentru identificarea rapidǎ a anticorpilor IgG-WNV folosind filme de poli(pirol-alchilamonium) pentru retinerea phagilor-WNV la suprafata electrodului de cǎrbune. Ca urmare au fost investigate proprietǎtile electrochimice ale electrozilor modificati cu polimer-phagi WNV, iar performantele analitice amperometrice ale imunosensorului cu conuratie optimizatǎ au fost determinate. Moleculele de phagi au fost modificate cu o secventa de 15 aminoacizi proveniti din anvelopa proteicǎ avirusul virusul  Nile West virusului (WNV) ce au fost folositi drept antigeni īn loc de virusul propriu-zis (phagi identici cu cei din modulul 6). Avantajul major al phagilor constǎ īn faptul cǎ sunt inofensivi pentru oameni iar preparea lor nu necesitǎ etape complicate de executie.

2.  Prepararea imonosensorului-WNV avānd la bazǎ phagi incapsulati īntr-un film de polipirol

            Dupǎ imobilizarea phagilor de electrod, a fost realizatǎ saturarea eventualelor siturilor non-specifice de adsoptie a proteinelor cu albumina sericǎ bovinǎ (BSA) sporind astfel sensibilitatea testului de dozare. Solutia blocanta a fost preparatǎ zilnic din solutie de tampon fosfat salinǎ (0.1 M PBS, pH = 2) continīnd 5 % (w/v) BSA. Din aceastǎ solutie s-au depozitat 20 µl pe electrodul modificat cu filmul polimeric de poli(pirol-alchilamonium) continīnd particule phagi si incubat pentru 1 ora la temperatura camerei. Apoi, imunosensorii au fost clǎtiti cu PBS (pH = 2) pentru 5 minute si incubati cu  20 µl solutie de anti-IgG WNV de concentratii diferite (de la 10 la 10⁷). Anticorpii-WNV au fost diluati cu o solutie de 1 % (w/v) BSA/PBST (PBS continīnd 0.05 % (v/v) Tween-20, PBST) si pǎstrati la 4°C. Electrozii rezultati au fost clatiti pentru 20 de minute cu solutia de PBST. Ulterior electrozii au fost incubati cu  20 µl de solutte de anticorpii-IgG marcati cu HRP (10²) pentru 20 de minute urmīnd clǎtirea lor pentru 20 de minute cu PBST īnainte de efectuarea mǎsurǎtorilor amperometrice (ura 1).

ura 1. Reprezentarea schematicǎ a principiului de functionare a imunosensorului amperometric pentru detectia anticorpilor-WNV prin intermediul anticorpului-secundar marcat cu HRP ce catalizeazǎ formarea speciilor electroactive de chinonǎ (Q) īn prezenta substratelor: hidrochinonǎ (HQ) si a H₂O_2.

3. Rezultate si discutii

1. Elaborarea electrozilor modificati cu polimer si phagi

            Comportamentul electrochimic al filmelor adsorbite de pirol-alchil amonium cu si fǎrǎ phagi a fost investigat prin voltametria ciclicǎ la suprafata electrodului de cǎrbune īn mediul apos continīnd 0.1M LiClO₄ drept electrolit suport. Prin scanǎri repetitive ale electrodului īn intervalul de potential 0 – 0.9 V  se observǎ aparitia quasi-reversibilǎ a sistemului de picuri īn jurul a 0.5 V (ura 2). Aceastǎ evolutie indicǎ formarea filmului de polipirol la suprafata electrodului de cǎrbune.

ura 2. Voltamogramele ciclice ale filmelor adsorbite de monomer de pirol-alchil amonium (120 nmol) īn timpul procesului de polimerizare si a polimerului obtinut. (A) monomerul singur; (B) monomerul amestecat cu 10 µl monomerul amestecat cu 20 µl phagi; (D) monomerul amestecat cu 30 µl phagi. Electropolimerizarea a fost efectuatǎ timp de 10 minute prin ciclarea potentialului īntre 0 si 0.9V /Ag/AgCl īntr-o solutie apoasǎ cotinānd 0.1M LiClO₄, cu o vitezǎ de scanare de 0.1V s^-l.

            Prezenta phagilor imobilizati, densitatea lor si acesibilitatea pentru imunoreactia cu anticorpii-WNV este direct reflectatǎ de intensitatea curentului obtinut la reducerea chinonei. Valorile de curent maxim (I_max) corespunzīnd a trei cantitati diferite de phagi (10, 20 si 30 µl) imobilizate prin CPE sau RPS sunt schematizate in Tabelul 2.

a) dupǎ marcarea cu anticorpul secundar-HRP īn prezenta H₂O₂ (0.1mM) si a 2 mM hidrochinonǎ , iar electrozii sunt potentiostati la 0 V.

2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-phagi WNV

            ura 3. ilustreazǎ voltamograma RDE obtinutǎ pentru filmul polimer-phagi. Permeabilitatatea (P_m) este estimatǎ folosind ecuatiile descrise anterior de Gough si Leypoldt [136-l38] (ura 3). Valorile de permeabilitate ale filmului de poli(pirol-alchil amonium) si cele ale polimerului continīnd phagi T7-Ep 15x2 (10 μl) sunt similare, 4.2  si respectiv 2.5 x 10^-2 cm s^-l. In plus, aceste valori de permeabilitate sunt similare cu cele raportate pentru acelasi tip de polimer (polipirol-alchil amonium) cu si fǎrǎ incapsularea glucoz-oxidazei (3 si respectiv 5 x 10^-2) [167].  Aceste rezultate ilustreazǎ cum fenomenul de incapsulare a phagilor īntr-un film de polipirol pentru o cantitate micǎ de phagi (10 μl) nu afecteazǎ permeabilitatea filmului si prin urmare structura sa.

ura 3. (A) 10 μl phagi T7 -Ep 15x2 in prezenta a 2 mM solutie de hidrochinonǎ dizolvatǎ in 0.1 M PBS (pH = 2). Voltamogramele electrodului turnant de carbon (diametru de 5 mm)  modificat cu filmul de poli(pirol-amonium):  (a) 3000, (b) 2500, (c) 2000, (d) 1500, (e) 1000, si (f) 500 rpm/min. Viteza de scanare a fost de 0.020 V s^-l. (B) Graficul Koutecky-Levich pentru (a) un electrod nemodificat, (b) pentru un electrod modificat cu un film polimeric si  (c) pentru un electrod modificat cu un film polimeric continānd 10μl phagi  T7lEp15x2 phage. Solutia test a fost 2 mM hidrochinonǎ īn solutia de 0.1 M PBS (pH = 2).

3. Performantele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV

            Pentru a investiga capabilitǎtile analitice ale electrozilor modificati cu polipirol-phagi pentru dozarea amperometricǎ a anticorpilor-WNV, electrozii cu phagi au fost incubati cu diferite dilutii de anticorpi-WNV īn intervalul de 10 pīnǎ la 10 Aceste rǎspunsuri de curent au fost proportionale cu concentratia anticorpilor, iar limita de detectie a fost de10⁷ (ura 4).

ura 4. Rǎspunsul de curent amperometric īnregistrat pentru imunosensorii-WNV īn prezenta sistemului hidrochinona/H₂O₂ īn functie de dilutiile de anticorpi-WNV (1:10 pǎnǎ la 1:10⁷). Potentialul aplicat este de 0V fatǎ de SCE.

            Dozarea amperometricǎ este mult mai sensibilǎ decāt alte technici ca testul colorimetric ELISA, testul chemiluminescent ELISA sau imunotestul bazat pe fibre optice [168] ce conduc la limite de detectie a titrului de anticorpi de 1:10⁵, 1:5x10⁵, si respectiv de 1:10⁶.

            De mentionat este rapiditatea rǎspunsului de curent a diferitilor imunosensori care este stabil dupǎ numai 5 la 20 secunde ceea ce ilustreazǎ o bunǎ permeabilitate a filmului de polimer-phagi.

            3. Concluzii

            Īn acest modul a fost demonstratǎ eficienta functionalizǎrii filmelor de polipirol cu phagi-WNV  cu pǎstrarea proprietǎtilor de recunoastere molecularǎ a anticorpilor specifici. Conuratia imunosensorului este bazatǎ pe grefarea fotochimicǎ a phagilor-WNV de un film electrogenerat la un potential de 0.850 V ce permite detectarea de anticorpi-WNV cu o sensibilitate extremǎ a titrului de detectie (1:10⁷). De asemenea, a fost posibilǎ regenerarea stratului sensibil de polimer-phagi folosind conditii acide  cu scopul fabricǎrii de noi WNV-imunosensori.