Construirea imunosensorilor amperometrici pentru determinarea anticorpilor anti-holerǍ bazati pe electrogenerarea filmelor permeabile de polipirol-biotinilat

Construirea imunosensorilor amperometrici pentru determinarea anticorpilor anti-holerǎ bazati pe electrogenerarea filmelor permeabile de polipirol-biotinilat

1. Introducere

            Luând în considerare problema permeabilitatii scazute a filmelor de polimer biotinilate, în acest modul se prezinta un nou protocol de construire de imunosensori amperometrici bazati pe electrogenerarea unui film original de copolimer biotinilat ce prezinta o foarte buna permeabilitate, ceea ce permite tranducerea sa amperometrica [79]. Filmul copolimeric prezinta grupe de biotina -ce permite ancorarea anticorpului sau antigenului prin intermediul interactiilor de afinitate cu avidina- si grupe de lactobionamida ce imbunatatesc caracterul hidrofilic al filmului organic electrogenerat si astfel permeabilitatea sa.

            Transducerea implica recunoasterea anticorpilor capturati de catre cel de-al doilea anticorp (anticorp secundar)  marcat cu enzima peroxidaza (ura 1). Performantele imunosensorului sunt investigate prin detectia amperometrica a oxidarii enzimatice a hidrochinonei în prezenta peroxidului de hidrogen.

ura 1. Fabricarea imunosensorului-HRP amperometric bazat pe sistemul electrochimic hidrochinona(HQ)/peroxid de hidrogen (H₂O₂).

2. Prepararea imunosensorului

            Etapele urmate în elaborarea imunosensorului la suprafata electrodului de carbune vitros au fost: mai întâi, 20 ”l solutie blocanta a fost depozitata la suprafata electrodului modificat cu filmul copolimeric biotinilat pentru a preveni acrosarea nespecifica a avidinei de acest film electrogenerat. Dupa etapa de blocare a electrodului a urmat construirea specifica a imunosensorului prin depozitarea a  20 ”l de avidina (1 mg/ml) dizolvata în 1 % (w/v) BSA/PBST si incubarea timp de 20 minute cu filmele biotinilate. Dupa clatirea cu PBS, electrozii rezultati au fost incubati pentru alte 20 de minute cu 15 ”l  toxina B a colerei-biotinilata [0.3 mg/ml dizolvata în 1% (w/v) BSA/PBST]. Apoi electrozii au fost clatiti cu PBS si incubati cu  20 ”l anticorpul anti-toxina colerei subunitatea B dezvoltat în iepure la o concentratie ce variaza în intervalul de 0.05 pâna la 500 ”g/ml. Timpul de incubatie a fost de 20 de minute, dupa care a urmat clatirea electrodului cu solutia de PBS. În final electrozii au fost incubati pentru alte 20 minute cu  20 ”l solutie de anticorp secundar IgG-anti-holera- marcat cu HRP în concentratie de 0.5 mg/ml ce a fost dizolvat în solutia  1% (w/v) BSA/PBST. Toti electrozii modificati (imunosensorii) au fost spalati cu solutia tampon PBS înainte de masuratorile amperometrice.

 Rezultate si discutii

1. Caracterizarea electrochimica a filmului de copolimer format din poli(pirol-biotina) si poli(pirol-lactobionamida)

 Desi electropolimerizarea monomerului de pirol-biotina furnizeaza un film compact si activ cu unitati de biotina, caracterul sau oragnic  impiedica umflarea polimerului în mediul apos si astfel îngreuneaza difuzia speciilor electroactive ca chinona la suprafata electrodului [188]. Pentru a îmbunatati detectarea amperometrica a chinonei au fost introduse prin electrocopolimerizare grupe hidrofilice de pirol-lactobionamida în scheletul polimeric de poli-pirol-biotina) pentru a contrabalansarea caracterului sau hidrofobic (ura 2).

ura 2. Structura monomerilor de pirol-lactobionamida (A) si de pirol-biotina (B).

ura 3. prezinta voltamograme ciclice ale speciei permeante electroactive -hidrochinona- la suprafata electrodului modificat fie cu filmul de polipirol biotinilat, fie cu filmul copolimeric-biotinilat, filme formate cu aceeasi sarcina de electropolimerizare, 1 mC. Prin area cu picul de oxidare a hidrochinonei  înregistrat la suprafata electrodului de carbon nemodificat se observa a scadere usoara a  intensitatii picului de curent (-l4%) ce este asociata cu cresterea separarii picului anodic si catodic pentru copolimer, în timp ce pentru filmul de pirol biotinilat se remarca o quasidisparitie picului anodic. Acesta indica clar ca homopolimerul impiedica drastic patrunderea hidrochinonei, în timp ce copolimerul apare mult mai permeabil. 

            Procesul de transfer de masa în filmele polimerice electrodepozitate la suprafata electrodului a fost investigat prin voltametria de electrod disc rotitor (RDE) [136-l38].

ura 3.  Voltamogramele ciclice în prezenta 1 mM hidrochinona si 0.1 M LiClO₄ în PBS (pH = 7) pentru (a) un electrod de carbune nemodificat (diametru de 5 mm), (b) un electrod modificat cu poli(pirol-biotina) si poli(pirol-lactobionamida) , (c) un electrod modificat cu polipirol biotina. Viteza de scanare a fost de 100 mV s^-l.

            ura 4A prezintǎ voltamogramele de disc-rotitor caractristice filmului copolimeric în solutta apoasǎ de hidrochinonǎ (1 mM).

            Experientele de voltametrie RDE au fost reprezentate sub forma de grafic Koutechy-Levich unde densitatea de curent limitǎ este reprezentatǎ în functie de pǎtratul rǎdǎcinii vitezei de rotatie (ura 4B). Din grafic, se observǎ un comportament liniar al copolimerului cu aceeasi pantǎ ca si electrodul nemodificat prezentând o intersectie pozitivǎ ce permite extragerea raportului D_mK/δ ca fiind  de 2.38 x 10^-2 cm s^-l.

2. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT

Pentru a determina sensibilitatea  de dozare a anticorpului-CT, imunosensorii au fost testati cu diferite concentratii de analit în domeniul de 0.01 -500 ”g/ml. Prin imersarea imunosensorilor-HRP în solutia de tampon continând 2 mM hidrochinonǎ, curentul de bazǎ s-a stabilizat dupǎ 4 minute iar semnalul de curent  a fost înregistrat dupǎ injectarea peroxidului de hidrogen în celula electrochimicǎ. Curba de calibrare pentru detectarea amperometricǎ a anticorpului CT a fost obtinutǎ dupǎ fiecare concentratie de anticorp-CT prin înregistrarea a rǎspunsului de curent caracteristic electrodului modificat (ura 5).

ura 5.  Curba de calibrare a imunosensorului-HRP cu anticorpii-CT in intervalul de 0.05 -500 ”g/ml folosind sistemul hidrochinona/H₂O₂.

3 Concluzii

            În acest modul se prezintǎ o nouǎ strategie de imobilizare a materialului imunologic de un electrod modificat cu un film copolimerict pentru dozarea anticorpilor specifici holerei. Studiul efectuat prezintǎ pentru prima datǎ  coelectropolimerizarea monomerilor de pirol-biotinǎ si pirol-lactobionamidǎ ca o variantǎ de film polimeric eficientǎ pentru ancorarea biomoleculelor în stare lor biologicǎ activǎ. Datoritǎ caracterului hidrofilic ridicat, monomerul de pirol-lactobionamidǎ sporeste considerabil permeabilitatea copolimerului  pentru speciile electroactive. Acesta a permis detectarea amperometricǎ rapidǎ si foarte sensibilǎ a anticorpului de holerǎ în combinatie cu un indicator enzimatic (peroxidaza).