Compararea a trei configuratii de imunosensori enzimatici pentru detectarea anticorpului anti-toxina holerei

Compararea a trei conuratii de imunosensori enzimatici pentru detectarea anticorpului anti-toxina holerei

1. Introducere

            Īn acest modul au fost fabricati imunosensori amperometrici pentru detectarea anti-toxinei holerice bazati pe imobilizarea materialului imunogenic (subunitatea B a toxinei holerei biotinilata) la suprafata electrodului biotinilat, folosind interactiile de afinitate avidina-biotina [78]. Analitul - anticorpul anti-toxina holerei- a fost detectat folosind alternativ trei markeri enzimatici: anticorpul IgG din iepure marcat cu peroxidaza (HRP), gluco-oxidaza biotinilata (Gox-B) sau polifenol oxidaza biotinilata (PPO-B) īn combinatie cu avidina legata de anticorpii IgG din iepure care a fost pentru prima data folosita pentru tranducerea unei imunoreactii. Pentru a asigura accesibilitatea speciilor active la suprafata electrodului si  imobilizarea calitativa a probei, au fost elaborate punti de avidina-biotina cu un film copolimeric biotinilat ce a fost obtinut prin electropoli-merizarea monomerului de pirol-biotina (pentru interactii de afinitate) si monomerului de pirol-lactobionamida (pentru īmbunatatirea permeabili-tatii). Prin metoda de electropolimerizare se asigura formarea unui film controlabil ca grosime, reproductibil, activ cu unitati de biotina, fara defecte, cu stabilitate chimica si de stocare īn timp [172, 175, 176, 188, 198].

2. Prepararea imunosensorilor amperometrici

Electropolimerizarea copolimerului bioti-nilat a fost realizata prin controlarea potentialului de electroliza la 0.85V īn electrolitul de acetonitril continīnd amestecul de monomer de pirol-lactobionamida (4 mM) si de monomer de pirol-biotina (4 mM). Luānd īn considerare natura reactiei electroenzimatice folosite pentru detectarea anticorpului anti-holera, electrozii de platina au fost utilizati pentru sistemul enzimatic bazat pe Gox-B, īn timp ce electrozii de carbune au fost folositi pentru HRP si PPO-B (ura 1).

ura 1. Schema electrozilor modificati cu subunitatea B a  toxinei holerei, biotinilate.

3. Tranducerea amperometrica a imunoreactiei

            Imunosensorii au fost incubati timp de 20 de minute cu anticorpul anti-toxina holerei (anti-CT, 20 µl) secretat īn iepure īn domuniul de concentratii de 0.05 pāaa la 500 µg/ml. Apoi, au fost investigate diferitele transductii electroenzimatice.

            Pentru imunosensorul-HRP, anticorpul secundaIgG marcat cu peroxidaza din hrean (20 µl) la o concentratie de 0.5 mg/ml si dizolavat īn diluantul de anticorp a fost depozitat  pe suprafata electrodului timp de 20 de minute. Apoi electrozii au fost clatiti insensiv cu PBS. Trei mediatori redox diferiti au fost folositi pentru testarea raspunsului amperometric a imunosensorilor-HRP: hidrochinona, ferocenul dicarboxilic, ferocianid (2mM) īn prezena a 2μM H₂O₂  (ura 2).

            Imunosensensorii-HRP au fost potentiostati la -0.1, -0.01 si -0.1V fata de SCE pentru detectarea unui din cei trei compusi enzimatici produsi amperometric: fericianuda, ferocenium,  si respectiv chinona.

ura 2. Imunosensori amperometrici folosind copolimerul [poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida)] pentru modificarea electrozilor de platinǎ sau cǎrbune cu cei trei markeri enzimatici (Gox-B,PPO-B, HRP) pentru detectarea antitoxinei holera. (A) HRP-imunosensor; (B) Gox-B imunosensor; (C) PPO-B imunosensor; Med_red/Med_ox = ferocianura/fericianuda; hidrochinona/chinona; ferocen/ferocenium; Gox - glucos-oxidaza biotinilatǎ, PPO-polifenol oxidaza biotinilatǎ; HRP-anticorpul IgG anti-iepure marcat cu HRP.

4. Rezultate si discutii

            Pentru a imobiliza CT la suprafata electrodului prin interactti de afinitate via puntilor de avidina-biotina, s-a folosit un nou film copolimeric biotinilat [poli(pirol-biotina), poli(pirol-lactobionamida)] ca un strat initial de ancorare. Acest film copolimeric a fost elaborat pentru īmbunatatirea sensibilitatii transductiei reactiilor enzimatice bazate pe detectarea amperometrica a produsilor enzimatici prezenti la suprafata electrodului. Catecolul a fost utilizat ca proba electrochimica pentru a ilustra diferenta īn permeabilitate dintre copolimerul biotinilat si filmul de poli(pirol-biotina). ura  3. prezinta o serie de voltamograme ciclice īnregistrate la 100 mV s^-l pentru electrodul nemodificat, electrodul modificat cu poli(pirol-biotina) si electrodul modificat cu copolimer.

ura 3. Voltamogramele ciclice ale electrozilor de platina (diametru de 5 mm): (a) electrod nemodificat, (b) electrod modificat cu copolimerul poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida), (c) electrod modificat cu polipirolul biotinilat īn prezenta a 1 mM catecol īn solutia apoasa de  0.1 M LiClO₄ (pH 7). Filmele polimerice au fost electrodepozitate prin controlarea potentialului de electroliza la 0.8 V (sarcina  de electropolimerizare a fost de 1 mC). Viteza de scanare a fost de 100 mV s^-l.

5. Raspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP

Conuratia enzimatica cea mai simpla a constat īn folosirea anticorpului secundar conjugat cu o enzima, īn cazul de fata HRP. Datoria spectrului larg de substrate enzimatice, trei sisteme electroactive (ferocianura/H₂O₂, acidul dicarboxilic/H₂O₂ si hidrochinona/H₂O₂) au fost alese pentru investigatia amperometrica. Timpul de raspuns pentru toti imunosensorii-HRP a fost extrem de rapid, variind īntre 5 la 30 de secunde. Acesta ilustreaza o permeabilitate buna a filmului copolimeric. ura 4. prezinta curbele de calibrare ale imunosensorilor-HRP pentru detectarea amperometrica a anti-CT prin intermediul celor trei substrate-HRP.

ura 4. Curbele de calibrare pentru anti-CT īn cazul imunosensorilor-HRP folosind diferite sisteme de mediatori redox /H₂O₂ ;( ■) hydrochinona, (□) ferocianid, (♦) ferocen.

6. Performantele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, si PPO-B

Sensibilitatea imunosensorului a fost determinata ca panta obtinuta din partea liniara a curbei de calibrare. Īn Tabelul 1. sunt prezentate valorile limitei de detectie, sensibilitatii si a curentului maxim (I_max) obtinute īn conditii de saturare a anti-CT pentru cele trei sisteme de detectie enzimatica. 

            Sistemul hidrochinona/H₂O₂ conduce la obtinerea celor mai bune performante analitice: cea mai scazuta limita de detectie (50 ng/ml) si cea mai ridicata sensibilitate (1.5 µAµg^-lml cm^-2). De asemenea, au fost īnregistrate valori ridicate ale I_max pentru formarea teoretica a unui monostrat de anti-CT si astfel a monostratului de HRP.

            Cele mai bune perfomante analitice obtinute cu substratul hidrichinona pot fii atribuite  dimensiunilor reduse ale cestui mediator redox ativ cu ferocianura si ferocenul, conducānd astfel la o mai buna permeabilitate īn filmul copolimeric.

            Valorile de detectie de 50 ng/mL anti-CT sunt similare cu cele obtinute cu imunosensorii bazati pe fibre optice folosind anticorpul secundar marcat cu HRP (160 ng/ml) [180, 181, 199, 200].

7. Raspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B si PPO-B ca markeri enzimatici īn constructia de imunosensori

            Cu scopul īmbunatatirii limitei de detectie, anticorpul secundar marcat cu HRP a fost īnlocuit cu anticorpul-biotinilat. Markerii enzimatici, Gox-B si PPO-B au fost atasati de anticorpul secundar prin puntea de avidina-biotina.

            ura 5A prezintǎ curba de calibrare a imunosensorilor Gox-B īn functie de concentratiile de anti-CT.

            Īn ceea ce priveste PPO-B, polifenol oxidaza biotinilatǎ este folositǎ pentru prima datǎ ca marker enzimatic īn fabricarea unui imunosensor. Acestǎ enzimǎ catalizeazǎ īn prezenta oxigenului oxidarea fenolului si o-difenolilor īn o-chinona. Ca urmare, detectia amperometricǎ a anti-CT a fost efectuatǎ īn prezenta a 10 mM catecol (principalul substrat al PPO) prin potentiostatarea imunosensorilor PPO-B la -0.2V fatǎ de SCE pentru a reduce o-chinona generatǎ. ura 6B prezintǎ urba de calibrare pentru imunosensorii PPO-B īn funttie de concentratiile de anti-CT.

ura 5. Curba de calibrare pentru anti-CT folosind (A) imunosensorii Gox-B īn  prezetta glucozei, E_applicat= 0.6V, (B) imunosensorii PPO-B īn prezeta catecolului; E_aplicat= -0.2V.

8. Concluzii

            Īn acest modul este demonstratǎ posibilitatea fabricǎrii de imunosensori pentru dozarea anticorpilor specifici pentru holera prin intermediul simplei imobilizǎri a materialului imunologic (toxina holerei) la suprafata electrodului modificat cu un nou film de pirol copolimeric ce poartǎ grupǎri de biotinǎ si lactobionamidǎ. Interactia antigen-anticorp este dozatǎ amperometric. Datoritǎ permeabilitǎtii bune a filmului copolimeric, a fost posibilǎ utilizarea a trei sisteme de transducere electroenzimaticǎ (HRP, Gox-B, PPO-B) pentru detectarea anticorpului de anti-toxina holerei, ce au fost ulterior studiate si ate īn ceea ce priveste performantele analitice obtinute pentru fiecare marker. Astfel, imunosensorii ce folosesc HRP prezintǎ cea mai sensibilǎ limitǎ de detectie (50 ng/ml).