IZOLAREA BACTERIILOR IN VITRO SI IN VIVO

Bacteriile se pot dezvolta, in afara organismului, in vitro, prin insamantare pe medii nutritive, si/sau in vivo, prin inoculare la animale de laborator sensibile.

IZOLAREA BACTERIILOR IN VITRO

MEDII DE CULTURA

Mediul de cultura reprezinta substratul nutritiv folosit pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor in conditii artificiale, iar cultura microbiana, totalitatea microorganismelor dezvoltate.

Prin utilizarea mediilor de cultura se pot izola microorganismele in cultura pura, ceea ce permite identificarea lor, studiul unor proprietati caracteristice, prepararea de antigene, vaccinuri si alte produse biologice.

CONDITIILE PE CARE TREBUIE SA LE INDEPLINEASCA MEDIILE DE CULTURA

Corectitudinea cercetarilor microbiologice depinde si de calitatea mediilor de cultura, acestea trebuind sa indeplineasca cateva conditii esentiale:

sa ofere substantele plastice si energetice necesare fiecarui microorganism (sa contina o sursa de N si C, factori de crestere, saruri minerale;

sa aibe un pH optim pentru specia respectiva, de obicei usor alcalin 7,2-7,4;

sa asigure, dupa caz, cerintele de aerobioza sau anaerobioza;

sa aibe un anumit grad de umiditate;

sa fie stabil (trebuie sa-si pastreze toate calitatile initiale pe toata durata incubarii);

sa fie sterile, pentru a nu se dezvolta si alte microorganisme, in afara celor insamantate;

sa se pastreze ferite de contaminare, atat inainte, cat si dupa folosire.

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

In prepararea mediilor de cultura trebuie respectate urmatoarele etape:

stabilirea retetei, respectarea cantitatii de ingrediente cu amestecul acestora in proportia si ordinea indicata;

verificarea pH-ului, eventual cu ajustarea acestuia;

filtrarea mediului pentru degrosisare (indepartarea sarurilor alcalino-pamantoase);

repartizarea in recipiente adecvate (eprubete, baloane) si sterilizarea in conditii care nu diminueaza proprietatile lor nutritive (autoclavare).

Controlul sterilizarii se face prin mentinerea la termostat 24 ore, timp dupa care mediile trebuie sa ramana in continuare sterile.

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURA

a. dupa consistenta

mediile lichide (apa peptonata, bulion): folosite in special pentru studiul unor proprietati ale microorganismelor si obtinerea toxinelor;

medii solide (geloza): utilizate mai ales pentru obtinerea microorganismelor in cultura pura.

b. dupa provenienta

medii naturale: nu necesita o prelucrare speciala (lapte, bila, ser, cartof);

medii artificiale: medii la care este obligatorie o prelucrare prealabila, pornind de la proteine animale (carne si organe de vita, faina de peste), sau vegetale (mazare, soia, drojdie);

medii sintetice: sunt acele medii compuse exclusiv din substante chimice (aminoacizi, factori de crestere, saruri). Compozitia mediilor sintetice variaza dupa dorinta experimentatorului, cu ajutorul lor putandu-se studia necesitatile nutritive ale diverselor specii microbiene;

medii semisintetice: sunt acele medii care pe langa substante chimice mai contin si proteine animale sau vegetale.

c. dupa compozitie si mod de utilizare

Medii uzuale sau simple

Pe aceste medii se dezvolta majoritatea microorganismelor, avand in compozitie extract de carne, peptona, clorura de sodiu. Pot fi:

lichide: bulion (utilizat ca mediu de inmultire si mentinere a bacteriilor, serviind ca element de baza pentru obtinerea mediilor lichide complexe), apa peptonata (utilizat ca mediu de imbogatire pentru vibrioni);

solide: geloza simpla (provine din bulion in care se introduce, la cald, fibrele unei alge marine din familia Florideea, cunoscute in comert sub numele de agar-agar, care-i confera acestuia suportul solid). Este utilizata pentru obtinerea fie de colonii izolate, fie de culturi masive, in functie de scopul urmarit (ura 1).

ura 1: Geloza simpla

Medii complexe

Sunt mediile cu adaus de lichide organice (sange, ser) sau zaharuri (glucoza, lactoza etc.) la mediile simple, pentru cultivarea speciilor mai pretentioase (gonococi, meningococi, hemofili), sau evidentierea unor proprietati. Prin adaugarea acestor ingrediente se obtin medii cu bulion-sange, bulion-ser, bulion-ascita, bulion glucozat sau geloza ser (sange, ascita)

mediul geloza sange (evidentiaza fenomenul de hemoliza caracteristic unor specii bacteriene (stafilococi, streptococi, pneumococi). Pentru izolarea gonococilor, meningococilor se foloseste un mediu derivat al amestecului geloza-sange, si anume, geloza chocolat.Acest mediu consta din sange defibrinat de berbec 5% peste care se toarna geloza incalzita la 70 C. Sub influenta caldurii se produce denaturarea mediului si punerea in libertate de aminoacizi necesari dezvoltarii unor specii bacteriene (ura 2);

medii elective asigura cu precadere dezvoltarea unui germen in raport cu alti germeni

mediul Loeffler cu ser coagulat de bou pentru izolarea bacilului difteric;

medii selective: selecteaza un anumit germen, continand substante bacteriostatice pentru flora de asociatie:

mediul Lowenstein Jensen, cu verde malahit pentru inhibarea florei de asociatie, pentru izolarea bacilului Koch. Mediul mai contine saruri minerale, amidon, ou, glicerina.

mediul hiperclorurat solid Chapman (clorura de sodiu, manita, rosu fenol) pentru izolarea stafilococilor manito-pozitivi patogeni;

mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric;