Diagnosticul de laborator in infectiile cu leptospire

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN INFECTIILE CU LEPTOSPIRE

Foarte raspandite in natura, leptospirele sunt bacterii care, emise prin urina animalelor infectate, determina la om, in mod accidental, infectii (zoonoze) cu un grad variat de gravitate, dintre care cea mai severa forma este leptospiroza ictero-hemoragica. Parte componenta a familiei Spirochetae, genul Leptospira cuprinde atat specii saprofite (Leptospira biflexa), cat si specii patogene pentru om si animal (Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona, Leptospira canicola). In patologia umana sunt descrise peste 230 de serotipuri, grupate in 23 de serogrupe, si 7 specii patogene asociate bolilor umane si animale.

Leptospirele sunt bacterii fin spiralate, flexibile, mobile cu extremitatile de forma unui carlig (ura 8). Au diametrul de aproximativ 0,1 mm si o lungime cuprinsa intre 6-l2 mm.

ura 1: Imaginea unei leptospire la microscopul electronic

(https://www.ucmp.berkeley.edu/bacteries.html)

Ca urmare a polimorfismului clinic, diagnosticul este greu de stabilit in etapa de debut a bolii. Contextul epidemiologic si testele de laborator nespecifice (neutrofilie, aspect de tip inflamator) sunt importante in vederea excluderii etiologiei virale.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Prelevatele vor respecta o anume secventialitate: hemoculturile se vor recolta in primele 10 zile de la aparitia sindromului febril (sangele fiind recoltat pe un anticoagulant de tipul heparinei sau oxalatului; citratul determina o acidifiere nefasta dezvoltarii leptospirelor), LCR, recoltat prin punctie rahidiana, in a 2-a saptamana de boala, iar uroculturile, incepand cu a 3-a saptamana de boala cand se recolteaza si sange pentru diagnosticul serologic. Prelevatele se vor recolta inaintea instituirii oricarui tratament cu antibiotice si nu vor fi congelate.

Prelevatele necroptice de la cadavru vor include probe de sange, de tesut hepatic si de tesut renal, LCR si urina.

Tinand cont de faptul ca leptospirele se lizeaza in cateva ore de la recoltare, transportul si prelucrarea produselor patologice va fi cat mai rapida.

2.DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

2.1 Examenul direct

Examenul direct al preparatului proaspat la microscopul cu fond intunecat este de interpretat cu prudenta, din cauza aspectelor fals pozitive determinate de resturi celulare, fibrina etc. Examinarea preparatului proaspat se face intre lama si lamela cu obiectivul cu imersie.

Pentru examinarea directa se foloseste: sange (5 ml) recoltat pe un anticoagulant fiind lasat un timp in repaus pentru sedimentarea hematiilor; urina (50-l00 ml) ca atare, dupa o prealabila alcalinizare prin administrarea bolnavului de bicarbonat de sodiu sau sedimentul urinar, dupa centrifugare timp de o ora la 3000 t/minut. Se mai pot examina prin acesta metoda si supernatantele trituratelor de fragmente de tesut din ficat, rinichi recoltate de la cadavru (2 g.tesut / 3-5 ml diluant lasat sa se sedimenteze timp de 30-60 minute).

Preparatele fixate si colorate se fac din sange, sedimentul urinar, LCR si amprente de organe post-mortem. Ca tehnici de coloratie se folosesc metoda Giemsa, coloratia Fontana-Tribondeau, cu acridina oranj si Vago (ura 9).

Metoda Giemsa: frotiul se usuca sau este fixat cu acid osmic, dupa care se coloreaza timp de 30 minute cu solutie Giemsa proaspata (2 picaturi de colorant/1 ml apa tamponata cu pH 7). Se spala si se recoloreaza cu Giemsa, dupa care preparatul se spala si se usuca. Examinarea la microscopul optic se face cu obiectivul cu imersie.

Coloratia Fontana-Tribondeau: frotiul etalat pe o lama port-obiect se acopera cu solutie Rugge pe baza de formol, acid acetic glacial, apa distilata; procedura se repeta de 3 ori in rastimp de 1 minut, dupa care se acopera lama cu acid tanic, se incalzeste pana la emisia de vapori si se lasa apoi sa se raceasca 3 minute. Se spala lama si se acopera cu filtrat de solutie amoniacala de nitrat de argint; se incalzeste din nou lama, de 2-3 ori, pana la emisia de vapori. Dupa 10 minute se spala cu apa distilata, se usuca si se examineaza la microscopul optic cu obiectivul cu imersie.

Coloratia cu acridina oranj este preferata de un numar important de microbiologi. Coloratia se practica pe preparatul etalat pe lama port-obiect si fixat in prealabil cu etanol. Se acopera frotiul timp de 2 minute cu amestecul colorant (acridina oranj 10 ml/tampon acetat pH 3,5 100 ml; se filtreaza si se pastreaza la intuneric). Se examineaza la microscopul cu fluorescenta si cu obiectivul cu imersie.

ura 9: Imaginea unei leptospire prin coloratia Vago

(sursa : https://www.bioltrop.org/15-techbacterio/leptospira.jpg)

2.2. Izolarea

Insamantarea in vederea izolarii leptospirelor se efectueaza in vivo si in vitro.

- In vitro, pe medii speciale semisolide si lichide, pe baza de peptona, imbogatite cu ser de iepure si adaos de factori care stimuleaza cresterea si multiplicarea germenilor, precum vitamina B1, vitamina B12, fier, hemoglobina, acid oleic. Mediile au pH 7,2-7,4. La noi este folosit indeosebi mediul Kortof. Mai sunt comercializate si utilizate mediile specifice Tween-albumina sau mediul EMJH (Ellinghausen-McCullough modificat de Johnson si Harris).

Sangele total se insamanteaza in 3 tuburi, fiecare tub continand cate 5 ml de mediu de cultura, in cantitate crescatoare de la o picatura la 3 picaturi; urina si LCR se insaminteaza ca atare sau sedimentul lor (0,5 ml inocul/tub cu 5 ml mediu de cultura).

Culturile sunt incubate la 30^oC, la intuneric, timp de 2 luni. Agitarea periodica a culturilor lichide stimuleaza cresterea (metabolism aerob).

Saptamanal se va efectua un examen direct la microscopul cu fond intunecat, cu respectarea stricta a normelor de protectie in vederea evitarii contaminarii umane accidentale (risc biologic de clasa a 2-a si a 3-a). Cand se observa leptospire se fac subculturi pe medii proaspete.

-In vivo se face prin inoculare la cobai sau, de preferat, la hamster care este sensibil la mai multe serovaruri. Tehnica prezinta cateva inconveniente deoarece leptospirele isi pierd repede virulenta in vitro, nu toate serovarurile produc semne clinice evidente, iar sensibilitatea animalelor de laborator variaza in functie de indivizi (sensibilitatea poate fi crescuta printr-un tratament prealabil cu ciclofosfamida).

2.3. Identificarea

Caracterele morfologice, mobilitatea si cresterea pe mediile speciale sustin apartenenta la genul Leptospira.

a. Caractere de cultura

Pe mediile specifice semisolide leptospirele se dezvolta lent, in grosimea mediului, la 2-3 mm de la suprafata, determinand aparitia a 5-6 tipuri de colonii identificate prin reactia oxidazelor. Speciile patogene au nevoie de un interval de timp mai mare, de peste 20 de zile, pentru a se dezvolta, in timp ce leptospirele nepatogene apar dupa 7 zile de la insamantare. Cresterea leptospirelor se apreciaza prin studiul culturilor la microscopul cu fond intunecat.

Pe mediile lichide cresterea leptospirelor nepatogene determina o usoara opalescenta, in timp ce tulpinile patogene nu produc modificarea claritatii mediului.

b. Caractere morfologice

La microscopul cu fond intunecat leptospitele apar ca microorganisme de forma spiralara, extrem de mobile, cu miscari de rotatie in jurul axului longitudinal, de flectatie si translatie, subtiri si stralucitoare pe fondul intunecat al campului.

Frotiurile colorate Giemsa si examinate cu microscopul optic evidentiaza leptospirele care au un aspect spiralat regulat, capetele indoite ca un carlig si o lungime dubla fata de dimensiunile unei hematii.

La coloratia speciala Fontana-Tribondeau leptospirele apar colorate maron spre negru pe fond galben-bej (ura 10).

Nu se coloreaza Gram

ura 10: Aspectul leptospirelor la coloratia Fontana-Tribondeau

(https://www.microbisome.com)

c. Caractere metabolice

In cazul leptospirelor patogene acestea sunt caracterizate printr-o activitatea ureazica slaba, folosesc acetatul de calciu ca sursa de carbon si fermenteaza inconstant zaharurile.

Sunt bacterii strict aerobe, catalaza pozitive, oxidaza negative.

d. Caractere de patogenitate

Animalele de laborator inoculate cu leptospire virulente dezvolta un sindrom febril, icter intens, hemoragii subcutanate si viscerale, urmate de deces in 4-5 zile. Probele necroptice din ficat, rinichi, sange, plamani evidentiaza prezenta leptospirelor.

Cobaii inoculati cu tulpini cu virulenta redusa, se vindeca spontan dupa un sindrom febril ce apare la 7-l2 zile de la inoculare. Animalele sunt sacrificate in a 2l-a zi de la inoculare, la examenul post mortem constatandu-se in special leziuni hemoragice pulmonare, leziunile hepatice si renale fiind mai rare.

Fragmentele de tesut recoltate sunt insamantate pe mediile de cultura specifice pentru izolarea leptospirelor.

e. Caractere antigenice

Pentru determinarea tipului serologic al leptospirei izolate se utilizeaza reactia de microaglutinare-liza pe lama. Pe o lama de sticla port-obiect se pune o picatura din cultura pozitiva cu leptospire si o picatura ser standard. Lama se lasa in repaus timp de 15 minute dupa care se examineaza la microscopul cu fond intunecat. In prezenta serului specific se produce aglutinarea leptospirelor.

Rezultatul se exprima in grade de intensitate a pozitivarii reactiei de la la ++++:

la o reactie negativa, leptospirele apar izolate pe campul miscroscopic, predominand formele libere;

la o reactie slab pozitiva (+) apar cateva leptospire aglutinate sub forma de gheme, predominand insa leptospirele libere;

intr-o reactie pozitiva (++) predomina ghemele de leptospire;

in reactia intens pozitiva (+++) ghemele sunt rare, iar leptospirele libere lipsesc;

in reactia intens pozitiva (++++) lipsesc ghemele si leptospirele.

3. DIAGNOSTIC IMUNOBIOLOGIC

Diagnosticul serologic este rezervat anumitor laboratoare de specialitate din cadrul Centrelor Nationale de Referinta. Testele se pozitiveaza din a 8-a sau a 10-a zi de boala cand apar anticorpii specifici. Titrul de anticorpi scade in urmatoarele 3-6 luni, un oarecare titru rezidual putand persista mai multi ani. Studiul cineticii anticorpilor este indispensabil pentru diagnosticul biologic, testele urmand a fi efectuate in dinamica, la interval de 2 saptamani.

Testul ELISA

Foloseste un antigen nepurificat extras dintr-o tulpina de Leptospira patoc anti-IgM umane cuplat cu peroxidaza. Titrul de granita este de 1/400. Anticorpii serici detectabili apar din ziua a 8-a de boala ce urmeaza instalarii sindromului febril. Principalul inconvenient este legat de faptul ca este destul de des negativ atunci cand infectia este determinata de anumite serotipuri precum L. grippotyphosa sau australis. In forma sa actuala testul ELISA este considerat un test de depistare.

RFC cantitativa

Foloseste ca antigen Leptospira biflexa Patoc I (2 unitati antigenice), un sistem hemolitic (eritrocite de oaie si ser hemolitic), seruri pereche de la bolnav, inactivate, recoltate unul in prima saptamana de boala, al doilea dupa 7-l2 zile si alexina titrata ( tehnica RFC). Anticorpii fixatori de complement ating valoarea maxima in saptamana a 3-a si a 4-a de boala, scazand catre finele lunii a doua de boala. Au valoare in diagnosticul precoce al bolii.

Reactia de micro-aglutinare

Cunoscuta si sub numele de reactia de aglutinare-liza MartinLepetit, reactia consta in evaluarea la microscopul cu fond intunecat a gradului de aglutinare a leptospirelor cu serul de bolnav. Reactia ramane tehnica de referinta pentru determinarea serotipului de leptospire si are la baza un set de antigene format din tulpini vii, reprezentative, ale principalelor serogrupe (20-23 de antigene).

Ca tehnica, pe o lama port-obiect de sticla se pun atatea picaturi din serul de bolnav, diluat 1/50, cate tulpini de testat sunt in setul de reactie. Se lasa in contact 15-20 de minute dupa care se examineaza la microscop.

Microaglutinatele din reactia pozitiva dau o imagine caracteristica de ,,cer instelat sau ca niste gheme mici. Liza (L) se caracterizeaza prin umflarea si imobilizarea leptospirelor care capata un aspect granular. Aglutinarea se noteaza: + daca sunt 4-5 gheme, ++ daca sunt peste 6 gheme si leptospire libere, +++ cand are loc aglutinarea tuturor leptospirelor de pe lama examinata. Un ser este considerat pozitiv, la o dilutie data si pentru tulpina testata, daca cel putin 50% dintre leptospire sunt aglutinate fata de o tulpina martor.

La om titrul prag de referinta corespunde valorii de 1/100, fiind semnificativa pentru diagnostic si cresterea in dinamica a titrului cu cel putin 4 trepte binare la serul de convalescenta fata de serul de debut.

Omul este sensibil la toate serotipurile de Leptospira interrogans sensu lato, gravitatea bolii depinzand mai mult de inocul, de virulenta tulpinii precum si de gradul de sensibilitate individuala, decat de serovarul propriu-zis. Toate serotipurilor pot antrena o forma grava, letala, cu toate acestea serovarurile grippotyphosa sau pomona, si mai ales, icterohaemorrhagiae au reputatia de a fi cele mai patogene.